本
文
摘
要
全文文献来源：598期刊网
摘要:对大肠杆菌工程菌产木聚糖酶的工艺进行优化,并对木聚糖酶的酶学性质进行研究。确定了提取工艺路线,即依 次经过细胞破碎(高速珠磨法)、固液分离及除菌(中空纤维 膜过滤)、超滤浓缩及烘干包衣步骤后得到肠溶木聚糖酶产品。该产品热稳定性好,在 pH 2.5 磷酸盐缓冲液中释放度为 5.0％,在 pH 5.5 磷酸盐缓冲液中释放度为9 8.5％,产品外 观光泽性好,能够很好地满足饲料酶市场要求。该木聚糖酶 的最适 pH 值为 6.4,最适温度为 55 ℃。该酶具有较好的热 稳定性,含水分 17％ 的酶在 9 0 ℃ 条 件 下2.5 min 仅失活1 3.6％。对木聚糖酶降解产物进行检测表明该木聚糖酶是一种内切酶。
关键词:木聚糖酶;大肠杆菌;酶学性质
木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase,EC.3.2.1.8) 是一类木聚糖降解酶系,属于水解酶类。木聚糖酶主要包 括:内切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。狭义上的木聚糖酶是指β-1,4-内切木聚糖酶。木聚糖酶可用于生物乙醇的生产,在食品、饲料等行业中也有着广泛的应用。
木聚糖酶是饲料主要用酶之一,其主要作用是分解由五碳糖聚合而成的半纤维素和木聚糖,主要分解产物有木糖、木二糖、木三糖和少量的 *** 糖。在食品工业中木聚糖酶也有着比较广泛的应用,在面包加工过程中添加适量的木聚糖酶不仅能提高面团的机械加工性能,还可以消除发酵过度的影响,增大面包体积,改善面包芯质地以及延缓老化。另外,近年来木聚糖酶广泛用于酶法生产低聚木糖上,作为功能性低聚糖的一种,低聚木糖在保健食品和医药行业有广泛的应用前景,对高脂血症有很好的治疗效果,能有效地降低血压、血清胆固醇[5]。目前,对木聚糖酶的研究侧重于高产木聚糖酶基因工程菌的构建、木聚糖酶诱导表达优化、木 聚糖酶功能基因的鉴定及比较等方面。中国生产木聚糖酶的厂家较少,因酶活力单位较低,质量不稳定,木聚糖酶产品主要依靠进口。因此开发高活性的木聚糖酶对打破国外厂家垄断、提高企业经济效益方面具有广阔的前景。本试验拟在前期研究[9]的基础上,对工程菌产木聚糖酶提取工艺进行探究,并对获得的木聚糖酶的酶学性质进行研究,以期为木聚糖酶工业化大生产提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
大肠杆菌工程菌发酵液:湖南尤特尔生化有限公司;
丙烯酸树脂:生化试剂,辽宁三环树脂有限公司;
中空纤维膜:PWSW-5 43 (0.1 μm,0.08 m 2 )、UMP15 3 (0.2 μm,0.08 m 2 )、ULP1 43 (0.45 μm,0.1 m 2 ),颇尔过滤器 (北京)有限公司; 陶瓷膜、陶瓷超滤膜管单孔道(0.2 μm,0.08 m 2 ):合肥世杰膜工程有限责任公司。
1.1.2 主要仪器设备精密pH 计:雷磁 PHS-3C 型,上海仪电科学仪器股份有限公司; 电热恒温鼓风干燥箱:DHG-9140A 型,上海精宏实验设备有限公司; 水分快速测定仪:SH10AD 型,上海良平仪器有限公司; 浊度测定仪:XZ-0 1 0 1 型,上海海恒机电仪表有限公司; 管式连续流离心机:GQ1 45WZ 型,上海佳毅机械设备公司; 板框压滤机:1 000 型,佛山金凯地过滤设备有限公司; 电热恒温水浴锅:HH-8 型,常州国华电器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 生产工艺流程
大肠杆菌→摇瓶种子→小罐种子→发酵罐发酵→细胞 破碎→中空纤维膜过滤 → 超滤浓缩 → 固液混 合 → 摇摆造粒→抛丸→烘干→筛分→包衣→配制→检验→包装→成品
1.2.2 酶的提取工艺 (1)珠磨法提取木聚糖酶的工艺:将发酵液冷却至1 8 ℃ 后,以同一进料速度连续流入 DYNO-mill ECM 珠磨机中, 在不同直径大小的研磨珠及其装填系数下进行细胞破碎,检测破碎液酶活。以实验室超声波破碎发酵液测得的酶活为参照,按式(1)计算细胞破碎率。
(2)膜分离设备选型及工艺参数优化:选用 PWSW-5 43 (0.1 μm,0.08 m 2 )、UMP15 3 (0.2 μm,0.08 m 2 )、ULP1 43 (0.45 μm,0.1 m 2 )3 种型号的膜柱,采用恒压过滤模式进行酶制剂澄清过滤。 膜柱化学清洗方法:试验结束后,用冷水、55 ℃热水冲洗,再使用 1％ 的碱 + 3 00 mg/L 过氧化氢在 55 ℃ 清洗 1 0 min。清洗完毕后,通过中空纤维膜柱水通量恢复率来考 察中空纤维膜堵塞程度,浊度用浊度测定仪测定。
(3)超滤浓缩木聚糖酶的工艺研究:将截留分子量为 5 000,8 000,1 0 000,20 000 D 聚醚砜(PES)卷式超滤膜分别装入超滤机中,取适量的中性木聚糖酶倒入超滤桶中,在 20 ℃ 同条件下进行浓缩。分别测定超滤透过液酶活、浓缩液酶活,按式(2)计算超滤收率。
