本
文
摘
要
描述：在实体组织和细胞内，胆固醇酯既是构成细胞质膜的成分，也是细胞内脂滴的主要分。细胞内胆固醇过度聚集与动脉粥样硬化泡沫细胞形成密切相关。实体组织和细胞的胆固醇测定远比血液胆固醇测定复杂。本试剂盒避免了有毒的有机溶剂抽提、繁杂的氮气吹干和脂质复溶等步骤，采用高效能试剂裂解细胞和提取胆固醇，优化了酶学反应和操作步骤，简单易行，灵敏度高，线性范围20~5000 µmol/L。
组成 (105次微板测定或30次1 ml比色杯测定)：
(1) 裂解液 50 ml (2)R1试剂 16 ml (3)R2试剂 4 ml (4)5 mmol/L胆固醇标准品0.5 ml
储存：4 ºC，储存三个月
所需设备：酶标仪、生化分析仪或721、722型可见光分光光度计。最佳工作波长550nm，如无此波长建议优先选用570nm、次选530、490nm。
操作步骤；
一. 组织细胞裂解:
裂解前，组织或细胞用PBS洗涤2次去除残存血液或培养基血清，以免影响胆固醇测定。
1) 培养细胞裂解：
消化、离心收集细胞或直接在培养皿内裂解。通常6孔板单孔约2x106个细胞，75cm2瓶约1x107细胞。按比例每1x106个细胞加0.1ml裂解液，震荡混匀，静置10分钟。
2) 细胞膜成分：
每5x106细胞制备的细胞膜组分，加入0.1-0.2ml裂解液（应根据预实验调整裂解液的量），震荡混匀，静置10分钟。
三、工作溶液配制: 按4:1比例，取4 ml试剂R1与1 ml试剂R2混匀，立即使用或4ºC保存<1天，变色弃去。
四、标准品稀释：将5 mM胆固醇标准品用无水乙醇稀释为2500、1250、625、312.5、156、78、39µmol/L。通常稀释4个点即可。注意设置零浓度空白对照管。
五、含量测定：
1. 取190 µl工作溶液加入微板。
2. 在各工作液中，分别加入10 µl (5~10µl) 空白对照溶液（无水乙醇或蒸馏水均可）、标准品、待测样品。样品体积不可超过20µl。如测量值超过线性范围可用裂解液稀释，根据稀释倍数计算浓度。
3. 37ºC或25ºC室温反应20分钟然后进行测定。（延长反应时间可能使游离胆固醇值增加，进而使游离胆固醇的数值与总胆固醇值接近。）
4. 先用蒸馏水（或无水乙醇）+工作液的空白管调零，然后测定各管OD值。
5. 绘制标准曲线并计算浓度。
6. 以每mg蛋白浓度或细胞数校正胆固醇含量。
