本
文
摘
要
无菌检查法是针对无菌或灭菌药品、原敷料及医疗器具等的无菌可靠性而建立的检查法，而无菌检测的可信度与抽样量、检查用的培养基质量、材料、操作环境、无菌技术、方法学的验证等有关。本文探讨与无菌检查法有密切直接关系的阳性对照菌种类的选择、茵量的多少、培养时间以及结果的判断，同时提出了具体改进意见，为2005版药典无菌检查法的修订提供参考
优质课程-除菌过滤技术的前世今生菌检查法是针对无菌或灭菌药品、原敷料及医疗器具等的无菌可靠性而建立的检查法，而无菌检测的可信度与抽样量、检查用的培养基质量、材料、操作环境、无菌技术、方法学的验证等有关。其中除抽样量一项外，其余均与阳性对照菌种类的选择、菌量的多少、培养时间以及结果的判断有直接的关系。
本文拟对2000年版《中国药典》无菌检查法的阳性对照菌对结果判断的确证作以探讨，并提出改进意见，为2005版药典无菌检查法的修订提供参考。
课件分享-叶非老师：无菌工艺的控制《中国药典》2000年版无菌检查法中涉及到阳性对照菌的共有3项试验：
(1)培养基的灵敏度检查法；
(2)抑细菌和抑真菌试验；
(3)检查法中的阳性对照。
质量检验记录016-对照菌接种记录其中第1项培养基的灵敏度检查是用来保证检查法中培养基的可信性，同时也对检查结果的可信程度给以保证。
第2项抑细菌和抑真菌试验是对供试品的抑菌特性作出判断，同时也是对所采用的检查法(直接法或薄膜法)、检查条件的验证试验。
第3项检查法中的阳性对照是评定检查方法可行性的重要依据。
可见上述3项试验并不是孤立的、简单的对培养基、供试品、检查法的3项检查，而是作为一个整体从三个不同方面来确保无菌检查法的可行性和可信度，三者的可信度都将直接影响无菌检查结论的可靠与否，因此三项检查在此基础上有着不可分割的内在联系，表现在阳性对照菌种类的选择、接种量的多少、培养时间以及对结果的解释。
2000年版《中国药典》无菌检查法中培养基的灵敏度检查法规定：菌种仅3种藤黄微球菌(Micro-coccus lutea)[CMCC(B)28001]、生孢梭菌(Clostrid-iumsporogenes)[CMCC(B)64941]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]。前2种用于检查液体硫乙醇酸盐培养基的灵敏度，后一种用于检查液体真菌培养基。接种量均为10-100个菌，每种培养基接种数量均为3管，培养时间5d。结果判定：以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。
2000年版《中国药典》无菌检查法中抑细菌和抑真菌试验规定：菌种也是3种，但用金黄色葡萄球菌(Staphycocouus aureus)[CMCC(B)26003]取代培养基灵敏度试验中的藤黄微球菌，其余2种相同。接种量同为10-100个菌，培养时间3-5 d结果判定；如培养基各管24 h内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。如加有供试品的培养基管与未加有供试品的培养基管对照比较微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判为供试品有抑菌作用。
2000年版《中国药典》无菌检查法有直接接种法和薄膜过滤法2种。前者规定：阳性对照菌仅为金黄色葡萄球菌1种，接种量10-100个菌，培养时间7d，阳性对照管24 h内应有菌生长。后者规定：根据供试品的特性在金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌3种中选择1种作为阳性对照菌，接种量10-100个菌，培养时间7d，阳性对照管细菌应在培养24-48h，真菌应在培养24-48h有菌生长。
针对2000年版《中国药典》无菌检查法中有关阳性对照菌的有关规定，从以下6个方面探讨上述规定的可行性及对无菌检查法有效性及可靠性的保证。
菌种管理及培养基质量控制01-菌种选择的种类
抑细菌和抑真菌试验中所选择的菌种决定了无菌检查法中的阳性对照菌种类，这是由于前者是作为后者的验证试验，其目的就是通过检测供试品抑菌性的有无、抑菌的种类来确定直接接种法和薄膜过滤法的适用性，即该试验确保了一个检品的无菌检查法的有效可行，而在无菌检查法中阳性对照菌液是为供试品作阳性对照试验用的。
阳性对照试验的目的，是检查阳性菌在加入供试品的培养基中能否生长，以确认所采用的试验条件是否符合要求(包括抑菌性的消除与否)、试验技术是否恰当。
因此，经抑细菌和抑真菌试验判断无抑菌性的供试品，采用直接接种法作为无菌检查方法，在检查法中选择的阳性对照菌不应仅为1种——金黄色葡萄球菌；经抑细菌和抑真菌试验判断有抑菌性的供试品，采用薄膜过滤法作为无菌检查方法，在检查法中选择的阳性对照菌应根据抑菌试验结果选择能指示抑菌性消除的对照菌的一种。
由于近年来新药物的不断增多，尤其抗感染药物的抗菌谱也不断拓广，单独针对革兰氏阴性的头孢三代及氟喹喏酮类药物种类的增加，使得在抑菌试验中必须有革兰氏阴性菌的代表菌株成为必然；另外，真菌种类繁多，但可根据单细胞或多细胞分为酵母菌和霉菌，两者在许多生物学特性上极为不同。同时，有窄谱的抗真菌抗生素对它们的抗菌活性不尽相同。因此，在阳性对照菌中金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌作为革兰氏阳性菌的代表，生孢梭菌作为厌氧菌的代表，白色念珠菌作为酵母菌的代表，还应增加革兰氏阴性菌和霉菌各1株。根据菌的生物学特性和抗菌药物的针对性，建议增加大肠杆菌和黑曲霉作为阳性对照菌。
培养基的灵敏度检查是对在高压灭菌后培养基的质量(即营养成分和无菌性)的保证，而判断培养基质量的好坏则以是否适合目的检出菌的生长为标准，同时目的检出菌以无菌检查法中的阳性对照菌为指示。因此培养基的灵敏度检查法阳性对照菌范围应无菌检查法中的阳性对照试验所选择的相一致，而不应仅考虑藤黄微球菌是自然环境中常见的非致病菌，对营养要求较严格，生长较慢等特性，就以此代替金黄色葡萄球菌，割裂了培养基灵敏度检查与无菌检查的内在联系，使无菌检查法试验失去对培养基质量的保证前提，在结果判断上造成无据可依(这一点将在结果判断中进一步探讨)，最终导致无菌检查法在逻辑上失去应有的严谨。
无菌取样相关操作及要求02-接种量
在上述3项试验所涉及的各个菌株，接种量均为10-100个菌。这将直接导致下述3项试验的结论：在培养基灵敏度试验中针对各种培养基的接种量至少在10个以上，说明无菌检查法中所用的培养基对在检验量内染有10个菌以下的检品，无检出能力，那么，无菌检查只能称其为限度检查；在无菌检查法中阳性对照的接种量至少在10个以上，说明该检查法如果供试品在检验量内含有10个以下菌，该检查法不能检出，那么以该方法进行无菌检查合格的结果只能报告该检验量下，含菌数小于10个。尽管无菌检查合格的概念并不是绝对意义上的无菌，但也应保证终灭菌品最多达到10-6的微生物存活概率。因此，接种量应准确规定为不超过100个。
03-培养时间
根据细菌、真菌的生长特性，培养时间应分别规定。而不应像目前在培养基灵敏度检查中统一规定为5 d并逐日记录结果，因为在此项试验中细菌重要的变化在前3d，而霉菌应在后3d。因此，在该项检查中应规定细菌培养3d，真菌培养5d；在抑细菌和抑真菌试验中由于供试品可能存在的抑菌性造成阳性对照菌生长缓慢等原因，因此培养时限应相对延长，而不应是目前规定的3～5 d，改为7 d较为合适。
无菌培养基灵敏度试验验证04- 结果判断
目前在培养基灵敏度检查法中规定，以每种菌株接种的3管培养基不得少于2管呈现生长，则该培养基的灵敏度符合规定；在抑细菌和抑真菌试验中规定：如培养基各管24 h内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。如加有供试品的培养基管与未加有供试品的培养基管对照比较微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判为供试品有抑菌作用；在无菌检查法中的直接接种法要求阳性对照应在24 h内生长，薄膜过滤法则要求阳性对照管细菌应在培养24～48 h，真菌应在培养24～72 h有菌生长。
由上述可见，培养基灵敏度检查的结果判断缺少必要的时间限制，接下来的两项试验中结果判断细菌24 h内生长，真菌48 h内生长，都没有必备的预试验的结论作为支持。另外，培养基灵敏度检查的结果判定标准“3管培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度符合规定”，也不尽合理，过宽的标准将导致如果阴性对照不长菌将有30％以上的可能性是培养基失去促菌生长的能力造成的，无菌检查中尤其是在薄膜过滤法的封闭式滤器中，由于供试品的细菌检查管、真菌检查管各是一只滤桶，因此若其无菌检查合格，那么也极有可能是培养基失去促菌生长的能力造成的假阴性。这就是说，在这种灵敏度判断标准下，无菌检查法的可靠性大大降低。
表述方法的不准确性表现在薄膜过滤法要求阳性对照管细菌应在培养24-48 h，真菌应在培养24-72 h有菌生长。薄膜过滤法作为无菌检查法的一种，是通过验证试验确保其抑菌性的消除。因此，在前24 h内不对其阳性对照菌进行要求，这是不合理的。
无菌检查直接接种法不易判断结果品种的方法改进05-结论
综上所述，适合于培养基灵敏度检查和抑细菌抑真菌试验的阳性对照菌株的选择、接种数量、培养温度及培养时间应满足附表所列条件见表1。
热力灭菌的动力学基础及无菌保证的基本概念--钱潍生表1适合于培养基灵敏度检查和抑细菌、抑真菌试验的阳性对照菌株、培养条件
06-有关2000年版《中国药典》无菌检查法中阳性对照菌项下的3点补充
6.1、为了保证阳性对照菌的生物学特性，应对菌种的传代次数作出规定，参照现行版美国药典、欧洲药典的无菌检查法和国际调和修正案(ICH)的无菌试验方法，规定如下：从冷冻干燥的原始菌种开启后计算，菌种的传代次数不得超过5代。
6.2、无菌检查法的阳性对照试验必须与供试品的无菌检查同时进行，但是要在无菌检查的结果前给予解释；当对一个新品种(包括品种不同、同一品种的不同厂家、同一品种的相同厂家不同规格)进行无菌检查时或试验条件有任何变化时，必须按规定做阳性对照试验。
6.3、薄膜过滤法阳性对照菌的菌液加入顺序，在2000年版《中国药典》无菌检查法中，没有明确指出，目前国内各检验单位通常采用的方法是，供试品过滤且冲洗完成后，将菌液直接加入培养基。而在国际调和修正案(ICH)的无菌试验方法中特别指出在冲洗滤膜的最后阶段，将菌液加入含有少量冲洗液的滤器中，过滤以后再加入培养基，这样就减少了由于薄膜质量问题而引起的漏检。
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